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NeatScript Reverse Transcriptase(P382)

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¥ 999.00
NeatScript Reverse Transcriptase (200 U/μL)
有效克服RNA复杂二级结构的反转录酶
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产品说明

本产品是一种经过基因工程改造的M-MLV(Moloney Murine Leukemia Virus)反转录酶,缺失了RNase H活性,保留了完整的聚合酶活性,具有极好的延伸能力,能够有效克服RNA复杂的二级结构对反转录的影响,不需要高温打开RNA二级结构进行反转录,在42℃条件下就能得到很好的反应效果,因此,非常适合用于cDNA第一链合成、cDNA文库构建等。

 

产品组分

组分 P382S P382M
NeatScript Reverse Transcriptase (200 U/μL) 50 μL*1 200 μL*1
5X NeatScript RT Buffer 1 mL*1 1 mL*4

  

单位定义
以Poly (rA) • Oligo (dT)为模板/引物,在37℃、10分钟条件下,掺入1 nmol的dTTP所需要的酶量定义为1个活性单位(U)。
 

储存条件
-20℃保存。
 

来源

重组E.coli,携带来源于M-MLV基因工程改造的反转录酶基因。

 

实验流程(cDNA第一链合成)
1.参考下表,在RNase-free Microtube管中配置混合液:

试剂 使用量/μL
Template RNA 1Total RNA≤5 μg, mRNA≤1μg
Oligo (dT)18 Primer (50 μM) [1] 1
dNTP Mix (10 mM each) 1
RNase free ddH2O Up to 10

[1] 也可以使用Random Hexamers (50 μM)或基因特异性引物GSP(2 μM)。


2. 65℃保温5分钟后迅速冰浴2~4分钟;
3. 短暂快速离心收集变性溶液于管底;
4. 在上述 Microtube 管中配制下列反转录反应液。

试剂 使用量/μL
上述变性溶液 10
5X NeatScript RT Buffer 4
RNase Inhibitor (40 U/μL) 0.5
NeatScript Reverse Transcriptase (200U/μL) 0.5~1 [1]
RNase free ddH2O Up to 20

[1] cDNA用于RT-PCR或cDNA克隆,推荐使用0.5 μL NeatScript Reverse Transcriptase; cDNA用于定量分析,例如定量PCR,推荐使用1 μL NeatScript Reverse Transcriptase。


5. 轻轻混匀;
6. 6.    如果以Random Hexamers进行反转录,须先30℃孵育10分钟,然后再42℃保温60分钟。
如果以Oligo (dT)18或GSP进行反转录,将上述反应液于42℃ [1]保温30-60分钟 [2]。

[1] 本产品具有极好的延伸能力,能够有效克服RNA复杂的二级结构对反转录的影响,但是如果使用GSP反转录发生引物错配,可以将反转录温度提高到50℃。
[2] 多数情况下30分钟即可,但如果目的片段较长,推荐延长时间至60分钟。

7. 70℃反应15分钟后冰浴冷却即得到cDNA溶液。

注意事项
1. 以Random Hexamers进行反转录,Random Hexamers在42℃条件下与模板RNA结合效率较低,因此须先30℃孵育10分钟,让Random Hexamers充分与模板结合并开始延伸,然后再42℃保温60分钟保证cDNA得到充分延伸。
2. 实验过程防止RNase污染:请保持实验区情节;实验操作穿戴干净的手套、口罩;实验所用的离心管、吸头等实验耗材均需保证RNase-free。

FAQs

Q1:本产品可以用原核生物RNA作为反转录模板吗?

A1:可以。
原核生物RNA没有polyA尾,不能使用Oligo (dT)进行反转录,需要使用Random Primers作为反转录引物。

 

Q2:延长反转录时间能否提高反转录效率?

A2:对于大多数基因,延长反转录时间不会显著提高反转录效率;对于部分GC含量较高或含高级结构的模板,适当延长反转录时间可提高反转录效率。

 

Q3:如何评判RNA质量?

A3:可从两个方面评价RNA质量:
(1)    RNA完整度。通过琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整度。以真核生物为例,完整的总RNA有清晰的三条带,分子量从大到小分别为28S、18S、5S,并且28S是18S亮度的两倍;若能看见三条带,但带型模糊或弥散,则说明RNA有部分降解,此时请立即进行反转录反应,并适量加大模板量;若只能看见分子量很小的一条带或没有条带,则RNA已完全降解,需要重新提取。
(2)    RNA纯度。RNA纯度可以通过OD260/280和OD260/230两个比值是否在1.8~2.1范围内进行判断,蛋白、有机物、盐离子等污染会导致比值降低。

 

Q4:如何从Oligo (dT)、Random Primers、GSP(基因特异性引物)中选择反转录引物?

A4:需要依据具体的实验情况进行选择。
(1) 随机引物:随机结合在RNA的任何区域,适用于rRNA、mRNA、tRNA等所有RNA类型的反转录反应。
(2) Oligo (dT):适用于具有PolyA尾的RNA(原核生物RNA、真核生物的rRNA和tRNA不具有PolyA尾)。由于Oligo (dT)结合在PolyA尾上,所以对RNA样品的质量要求较高,即使有少量的降解也会使全长cDNA合成量大大减少。
(3) 基因特异性引物:与模板序列互补,适用于序列已知的基因反转录。
cDNA后续进行PCR扩增长片段,一般用Oligo dT或者基因特异性引物,不建议使用随机引物,因为随机引物是随机结合的,cDNA片段会偏短,增加后续扩增全长目的基因的难度;cDNA后续进行qPCR,一般使用Oligo dT和随机引物的混合物,可以避免3’端和5’端的扩增偏好性。

 

说明书

NeatScript Reverse Transcriptase_manual.pdf (点击下载)