NeatScript Reverse Transcriptase（P382）
有效克服RNA复杂二级结构的反转录酶
- 货号/规格
产品说明
本产品是一种经过基因工程改造的M-MLV（Moloney Murine Leukemia Virus）反转录酶，缺失了RNase H活性，保留了完整的聚合酶活性，具有极好的延伸能力，能够有效克服RNA复杂的二级结构对反转录的影响，不需要高温打开RNA二级结构进行反转录，在42℃条件下就能得到很好的反应效果，因此，非常适合用于cDNA第一链合成、cDNA文库构建等。
产品组分
| 组分 | P382S | P382M |
| NeatScript Reverse Transcriptase (200 U/μL) | 50 μL*1 | 200 μL*1 |
| 5X NeatScript RT Buffer | 1 mL*1 | 1 mL*4 |
单位定义
以Poly (rA) • Oligo (dT)为模板/引物，在37℃、10分钟条件下，掺入1 nmol的dTTP所需要的酶量定义为1个活性单位（U）。
储存条件
-20℃保存。
来源
重组E.coli，携带来源于M-MLV基因工程改造的反转录酶基因。
实验流程（cDNA第一链合成）
1.参考下表，在RNase-free Microtube管中配置混合液：
| 试剂 | 使用量/μL |
| Template RNA | 1Total RNA≤5 μg, mRNA≤1μg |
| Oligo (dT)18 Primer (50 μM) [1] | 1 |
| dNTP Mix (10 mM each) | 1 |
| RNase free ddH2O | Up to 10 |
[1] 也可以使用Random Hexamers (50 μM)或基因特异性引物GSP(2 μM)。
2. 65℃保温5分钟后迅速冰浴2~4分钟；
3. 短暂快速离心收集变性溶液于管底；
4. 在上述 Microtube 管中配制下列反转录反应液。
| 试剂 | 使用量/μL |
| 上述变性溶液 | 10 |
| 5X NeatScript RT Buffer | 4 |
| RNase Inhibitor (40 U/μL) | 0.5 |
| NeatScript Reverse Transcriptase (200U/μL) | 0.5~1 [1] |
| RNase free ddH2O | Up to 20 |
[1] cDNA用于RT-PCR或cDNA克隆，推荐使用0.5 μL NeatScript Reverse Transcriptase; cDNA用于定量分析，例如定量PCR，推荐使用1 μL NeatScript Reverse Transcriptase。
5. 轻轻混匀；
6. 6. 如果以Random Hexamers进行反转录，须先30℃孵育10分钟，然后再42℃保温60分钟。
如果以Oligo (dT)18或GSP进行反转录，将上述反应液于42℃ [1]保温30-60分钟 [2]。
[1] 本产品具有极好的延伸能力，能够有效克服RNA复杂的二级结构对反转录的影响，但是如果使用GSP反转录发生引物错配，可以将反转录温度提高到50℃。
[2] 多数情况下30分钟即可，但如果目的片段较长，推荐延长时间至60分钟。
7. 70℃反应15分钟后冰浴冷却即得到cDNA溶液。
注意事项
1. 以Random Hexamers进行反转录，Random Hexamers在42℃条件下与模板RNA结合效率较低，因此须先30℃孵育10分钟，让Random Hexamers充分与模板结合并开始延伸，然后再42℃保温60分钟保证cDNA得到充分延伸。
2. 实验过程防止RNase污染：请保持实验区情节；实验操作穿戴干净的手套、口罩；实验所用的离心管、吸头等实验耗材均需保证RNase-free。
FAQs
Q1：本产品可以用原核生物RNA作为反转录模板吗？
A1：可以。
原核生物RNA没有polyA尾，不能使用Oligo (dT)进行反转录，需要使用Random Primers作为反转录引物。
Q2：延长反转录时间能否提高反转录效率？
A2：对于大多数基因，延长反转录时间不会显著提高反转录效率；对于部分GC含量较高或含高级结构的模板，适当延长反转录时间可提高反转录效率。
Q3：如何评判RNA质量？
A3：可从两个方面评价RNA质量：
(1) RNA完整度。通过琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整度。以真核生物为例，完整的总RNA有清晰的三条带，分子量从大到小分别为28S、18S、5S，并且28S是18S亮度的两倍；若能看见三条带，但带型模糊或弥散，则说明RNA有部分降解，此时请立即进行反转录反应，并适量加大模板量；若只能看见分子量很小的一条带或没有条带，则RNA已完全降解，需要重新提取。
(2) RNA纯度。RNA纯度可以通过OD260/280和OD260/230两个比值是否在1.8~2.1范围内进行判断，蛋白、有机物、盐离子等污染会导致比值降低。
Q4：如何从Oligo (dT)、Random Primers、GSP（基因特异性引物）中选择反转录引物？
A4：需要依据具体的实验情况进行选择。
(1) 随机引物：随机结合在RNA的任何区域，适用于rRNA、mRNA、tRNA等所有RNA类型的反转录反应。
(2) Oligo (dT)：适用于具有PolyA尾的RNA（原核生物RNA、真核生物的rRNA和tRNA不具有PolyA尾）。由于Oligo (dT)结合在PolyA尾上，所以对RNA样品的质量要求较高，即使有少量的降解也会使全长cDNA合成量大大减少。
(3) 基因特异性引物：与模板序列互补，适用于序列已知的基因反转录。
cDNA后续进行PCR扩增长片段，一般用Oligo dT或者基因特异性引物，不建议使用随机引物，因为随机引物是随机结合的，cDNA片段会偏短，增加后续扩增全长目的基因的难度；cDNA后续进行qPCR，一般使用Oligo dT和随机引物的混合物，可以避免3’端和5’端的扩增偏好性。
说明书
NeatScript Reverse Transcriptase_manual.pdf (点击下载)
